关键词:明胶酶谱服务|实验技术服务

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明胶酶谱服务|实验技术服务——pczn1质粒+arctic express宿主菌低温表达体系。

我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。

产品品牌：明胶酶谱服务|实验技术服务

测序实验流程：

酶谱法的基本过程是先将样品进行sds-聚酰胺(sds-page，含0.1%明胶)电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的mmp-2和mmp-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与mmp-2和mmp-9活性成正比。

试剂的配制折叠编辑本段

(1)配制10%sds聚酰胺凝胶(含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高)

a.分离胶的配制(注:根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量)

10% sds聚酰胺凝胶 10ml(包括)

ddh2o 4.5ml

30%储备胶(0.8%bis+29.2%酰胺) 2ml

1.5mol/l tris(ph 8.8) 2.5ml

10% sds 100u

10%(aps) 100ul

temed 8ul

1%明胶(1g明胶-->100ml，37°c水浴溶解) 0.5ml

b.浓缩胶的配制

浓缩胶 6ml

ddh2o 4.5ml

30%储备胶 0.75ml

1mol/l tris-hcl( ph 6.8) 0.76ml

10% sds 60ul

10% 60ul

temed 6ul

(3)5×tris –甘酸电极缓冲液

0.125mol/l tris-hcl，1.25mol/l 甘酸，0.5%sds(ph 8.3)

(4)4 ×上样缓冲液

0.32% tris-hcl 6.4ml

4%sds(ph7.2) 8ml

16%甘油 3.2 ml

蓝 0.024g

ddh2o 2.4ml

(5) 洗脱液:2.5% triton x-100，50mmol/l tris-hcl<6.057g/l> ，5mmol/l cacl2<0.5549g/l>，ph7. 6 (40分钟两次，中间换液)

(6)漂洗液: 50mmol/l tris-hcl， 5mmol/l cacl2，ph7. 6 (20分钟2次)

(7)孵育液:50mmol/ltris,ph7.5,150mmol/lnacl,10mmol/lcacl2,0.02%nan3(孵育42小时)

(8)染色液:0.05% coomassic 亮蓝 r-250，30%，10%(染色3小时)

(9)脱色液a、b、c:浓度分别为30%、20%、10 % ,浓度分别为10 %、10 %、5% (分别30min、1h、2h脱色)

实验步骤

1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基dmem中培养24h。

2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。

3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度(或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致)。与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。(不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡)

4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样(根据表达强度和蛋白浓度确定上样量)，4℃进行sds-page 电泳100v约1.5小时(电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直)。

5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% triton x-100，50mmol/l tris -hcl ，5mmol/l cacl2，ph7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含triton x - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/l tris - hcl , 5mmol/ cacl2 , 0. 02% brij-35 ,ph7.6) 中37℃ 孵育42h。

6.孵育结束后经染色液(0.05% coomassic 亮蓝、30%、10%) 染色3h,及脱色液a、b、c(浓度分别为30%、20%、10 % ,浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出mmp-2(72kd) 和mmp -9(92 kd)为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。

注意事项

1.制备聚酰胺时应注意排除气泡 。

2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和ph值等因素的影响，因此缓冲液 配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的ph好在7.5-7.6，复性的triton时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。

5.孵育的37度不要在co2培养箱中，因为会改变孵育液的ph值，在普通孵箱即可。

6.明胶要4度保存，配好后1周内使用