关键词:半定量rt-pcr服务|实验技术服务

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半定量rt-pcr服务|实验技术服务——pczn1质粒+arctic express宿主菌低温表达体系。

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测序实验流程：

半定量rt-pcr一般是在没有条件做 实时pcr 的情况下使用，用于测定体内目的基因的表达增加减少与否，即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因(如β-actin)的电泳带的相对含量比较，观测目的基因表达增减，另外还要做一个β-actin的内参照对照。

1 样品rna的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的trizol试剂裂解的样品中加入0.2ml的仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色仿相，中间层以及无色水相上层。rna全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的trizol试剂的60%。

③rna沉淀 将水相上层转移到一干净无rna酶的离心管中。加等体积异混合以沉淀其中的rna，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的rna沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④rna清洗 移去上清液，每1mltrizol试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%（75%用depch2o配制），清洗rna沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤rna干燥 小心吸去大部分溶液，使rna沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解rna沉淀 溶解rna时，先加入无rna酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的rna溶液保存于-80℃待用。

2 rna质量检测

1）紫外吸收法测定

先用稀释用的te溶液将分光光度计调零。然后取少量rna溶液用te稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定rna溶液 浓度和纯度。

① 浓度测定

a260下读值为1表示40 μg rna/ml。样品rna浓度(μg/ml)计算公式为：a260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：

rna溶于40 μl depc水中，取5ul，1:100稀释至495μl的te中，测得a260 = 0.21

rna 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5ul用来测量以后，剩余样品rna为35 μl，剩余rna总量为：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

②纯度检测

rna溶液的a260/a280的比值即为rna纯度，比值范围1.8到2.1。

2）变性琼脂糖凝胶电泳测定

①制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× mops电泳缓冲液和18 ml的37% 溶液(12.3 m)。

10×mops电泳缓冲液

浓度 ?成分

0.4m ?mops，ph 7.0

0.1m ?钠

0.01m ?edta

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×mops电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

②准备rna样品

取3μgrna，加3倍体积的上样染液，加eb于上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

③电泳

上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6v/cm电压下2h，电泳至兰指示剂进胶至少2–3cm。

3,待测样品的待测基因实时定量pcr

①所有cdna样品分别配置实时定量 pcr反应体系。

体系配置如下：

序号 ?反应物 ?剂量

1 ?sybr green 1 染料 ? 10 ul

2 ?上游引物 ?1ul

3 ?下游引物 ?1ul

4 ?dntp ? 1ul

5 ?taq聚合酶 ?2ul

6 ?待测样品cdna ?5ul

7 ?ddh2o ? 30ul

8 ?总体积 ?50 ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

②将配制好的pcr反应溶液置于realtime pcr仪上进行pcr扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，后72℃7分钟延伸。

4, 实时定量pcr使用引物列表

引物设计软件：primer premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发dna 聚合反应(即错配)。