关键词:总rna提取服务|实验技术服务

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总rna提取服务|实验技术服务——pczn1质粒+arctic express宿主菌低温表达体系。

我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。

产品品牌：总rna提取服务|实验技术服务?

测序实验流程：

（一）细胞总rna的提取

1、6孔板细胞汇合度为90-时，取出无菌室，去其上清，用pbs洗两次后，每孔加trizol试剂 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5 min。

2、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一depc处理过的1.5 ml ep管中，加新开的仿0.2 ml，轻摇15 s。

3、室温静置2-3 min后，12000 rpm，15 min，4 ℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 ep管（depc处理过），加0.5 ml新开的异，室温下静置10 min。

4、12000 rpm，10 min，4 ℃，离心。观察总rna在管底的白色沉淀，弃去上清，75%1.0 ml洗涤（用depc水新配制）后，7500 rpm，5 min，4 ℃离心。

5、去上清，点离，用小tip吸干液体。气干沉淀5-10 min， depc处理水20-30 μl加入，中枪打匀，55-60 ℃水浴10 min溶解总rna，测od值。

6、电泳。

（二）从总rna中分离mrna（oligotex mrna mini kit,cat.no.:70022, qiagen）

1、取上述提取的总rna若干（少于0.25 mg）到一个新的无rnase 的ep管中，用无rnase的水定容到250 μl。

2、加入buffer obb 250 μl, oligotex suspension 15 μl。用tip打匀或用手弹匀。

3、70℃水浴，3 min（裂解rna的二级结构）。

4、20-30℃条件下，静置10 min（让oligotex与mrna结合）。

5、高速离心2 min，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 μl的上清在原管里。

6、用buffer ow2 400 μl重悬含oligotex/mrna复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml ep管的spin柱子上，高速离心1 min。

7、将spin柱子移到一个新的ep管上，加buffer ow2 400 μl到柱子，高速离心1 min，丢掉滤过液。

8、将spin柱子移到一个新的ep管上，加20-100 μl热的（70 ℃）buffer oeb到柱子上，用tip来回吸打3-4 次，高速离心1 min。

10、电泳。

9、为保证大的 mrna产量，可再次重复第8步。

1. 六孔板每孔细胞中加入1ml trizol，冰上放置5min，枪头吹打。

2. ?将各孔裂解液吸到1.5 ml ep管中，加入仿0.2ml/管，用力振摇15s。15－30℃下孵育2-3min，离心（4℃，12,000g，15min）。

3. ?离心后液体分为三层（上层－无色水样层为rna，中层白色为dna和底层红色为蛋白质），小心吸取上层无色液体移入一新的ep管中。

4. 加入等体积异，0.4－0.5ml，混匀，15-30℃下孵育10－30min，离心（4℃，12，000g，10min）。其中如果加入等体积异后，置于试管架上用pe手套密封后，放于4℃冰箱中，沉淀30min效果更好。

5. 去上清，沉淀加入75％1ml，漩涡振荡30s，离心（4℃，7,500g，5min）。

6. ?小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。好是用枪头吸取上清，尽量除去。

7. 加入20ul depc水溶解，分装5ul/管，-70℃冰箱保存。

8. 细胞总rna的鉴定：0.9-1.2％琼脂糖电泳鉴定细胞总rna，观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定：分别测定细胞总rna在260nm和280nm处的光密度值(od)，并计算rna的含量和纯度。